# 常见问题

{% if data.FileExists("Filter") %}

## 数据过滤

### 关于测序数据质量有哪些指标?

Q20和Q30，一般我们要求Q20>=90%,Q30>=85%

### Clean Reads的碱基质量分布为什么是以横线的形式表现的，而不是点?这些线是取的平均值还是什么值？像是不连续的数据？

1.实际上是点过于密集，连成了线;2.这是每个reads上相应位置的碱基质量进行绘图的结果，是实际值，而非平均值;3.的确是不连续的，但是不论是位置或是质量，数字间隔都是整数1，该数据是PE90测序，所以在90 处，高质量碱基会出现断裂，是测序本身5’稳定性差造成的。

{% endif %}

{% if data.FileExists("Quantification") %}

## 定量分析

### FPKM与RPKM有什么区别？

FPKM与RPKM计算方法基本一致。不同点就是FPKM计算的是片段（fragments），而RPKM计算的是数据（reads）。Fragment比read的含义更广，因此FPKM包含的意义也更广，可以是pair-end的一个fragment，也可以是一个read。RPKM的诞生是针对SE测序，FPKM则是在PE测序上对RPKM的校正。

### 是否需要生物学重复？重复几次？

是的，至少需要两次生物学重复，3次以上的生物学重复更好。2011年7月Hansen[1]发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性，与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复，高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。
理想情况下，样本间的相关系数需要达到多少？
根据Encode计划建议的标准，属于生物重复的两个样品，相关性Person系数的平方（R2）应≥0.92（理想的取样和实验条件下）。参照：Standards, Guidelines and Best Practices for RNA-Seq https://genome.ucsc.edu/ENCODE/protocols/dataStandards/ENCODE_RNAseq_Standards_V1.0.pdf

{% endif %}

{% if data.FileExists("Coverage") %}

## 基因覆盖分析

### 基因的覆盖情况能精确到转录本水平吗？

目前不能，因为我们是根据比对结果进行统计的，当转录本之间存在overlap时，我们无法区别，结果给出的是该转录本区间的reads覆盖情况，但不能区分转录本。因此需要用到转录本的覆盖情况的时候，必须要考虑它的表达量。因为RSEM在计算表达量的时候用了最大似然法去区别了不同转录本的reads分配情况，但它没有给出分配的细节，只给出了表达量。

{% endif %}

{% if data.FileExists("Cluster_Mfuzz") %}

## 时间序列分析

### 时间序列分析与一般的聚类方法有什么区别？

时间序列分析是使用相对量进行聚类，因此它对变化趋势非常敏感。而一般聚类方法是使用绝对量进行聚类，因此它更容易将表达量相近的基因聚类在一起。

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/cluster.png
subTitle: 图1 时间序列分析与一般聚类分析的区别
```
{% endif %}

{% if data.FileExists("Rich") or data.FileExists("Rich_target") or data.FileExists("Rich_mfuzz") or data.FileExists("Rich_wgcna") %}

## GO富集分析

### 结果的文件命中有三种前缀“go_c”，“go_f”，“go_p”，它们代表什么意思？

它们分别为GO的三大分类：C 细胞组分（cellular component）、F 分子功能（molecular function）、P 生物过程（biological process）

{% endif %}

{% if data.FileExists("Rich") or data.FileExists("Rich_target") or data.FileExists("Rich_mfuzz") or data.FileExists("Rich_wgcna") %}

## KEGG富集分析

### 为什么KEGG的pathway图中一个方框里面同时出现红绿色标记?

方框里面基本都是一些酶或者是有催化活性的蛋白，而我们知道有些关键的酶或重要的蛋白会有多个同源基因编码，所谓的同工酶；还有一些由多个亚基聚合而成，每个亚基由不同的基因编码，也就是说这些重要的酶或者蛋白有不同的基因（转录本编码），那么有时候会出现不同基因表达不一致的情况。针对于这部分结果，建议略过不看，如果要利用这部分数据，那么需要去做深入的文献阅读了解哪些基因属于比较重要的基因，或者哪些亚基属于催化或者结合中心。

{% endif %}

{% if data.FileExists("SnpIndel/SNP") or data.FileExists("SnpIndel/Indel") %}

## SNP和InDel分析

### VCF的格式是怎样的？

VCF格式用于存储变异数据信息，例如SNP，INDEL，CNV和SV等，详细说明见UCSC官方描述 http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html#format10.1

{% endif %}

{% if data.ProjectInfo.ProjectType == 'lncRNA' or data.ProjectInfo.ProjectType == 'Hiseq_lncRNA' %}

## lncRNA的miRNA前体预测

### 只比对到本物种的miRNA前体吗

我们是将lncRNA比对到整个mirbase数据库，并不区分物种。因为比对是独立进行的，若你只关注本物种的mirRNA前体，你可以将其他物种的比对结果忽略。

## lncRNA家族分析

### 如何查找基因家族的详细信息？

基因家族的数据库源自xfam，你可以在它的官网上查找到详细的家族描述信息。官网：http://rfam.xfam.org/

{% endif %}

{% if data.FileExists("Target")%}

## lncRNA靶基因预测

### Cis调控的具体机理是什么？

cis调控的机理很复杂，有通过影响聚合酶进行调控，也有通过影响启动子进行调控，调控的机制很多。关于这方面可以参考这两篇综述：1）Gene regulation by the act of long non-coding RNA transcription ：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed//?term=23721193 ；2）Regulatory mechanisms of long noncoding RNAs in vertebrate central nervous system development and function ：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed//?term=23337534

{% endif %}

### qPCR实验怎么挑选验证的基因?

验证的时候一般需要验证lncRNA和它的靶基因。具体选择哪些，取决于做测序的初衷，或者说您要解决的生物学问题，然后结合GO富集和KEGG富集的结果入手，看看您关注的基因是否存在表达量的差异。建议选择表达量高、样本间表达差异倍数大、基因覆盖情况较好的基因进
行验证。选择很低表达量的基因进行qPCR验证时，出现与测序结果不符合的概率会上升。