{% extends 'templates/global/base.md' %}

{% block content %}

# 分析方法

## 实验流程

实验操作中的每一步（如样品检测、文库构建到最测序）都会影响数据数量和质量，从而影响后续信息分析结果。为了得到高质量测序数据，我们对一步都进行严格的质控。实验流程见{{data.RenderAnchorLink("figure", "图", fn)}}。

{{data.RenderAnchor("figure", fn)}}

```image
url: {{data.RenderExpFlowUrl("cn")}}
subTitle: 图{{fn}}  实验流程图
```

{{ data.RenderExpStep("cn")}}

{% set fn = fn + 1 %}


## 信息分析流程

{% if data.ProjectInfo.ProjectType == 'lncRNA' or data.ProjectInfo.ProjectType == 'Hiseq_lncRNA' %}

测序所得数据称为raw reads。首先，我们过滤掉rRNA，低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，过滤后的数据称为clean reads。然后将clean reads比对到参考基因组上，之后进行转录本组装。对于组装得到的新转录本，我们将进行编码能力预测，以区分新的lncRNA和新的mRNA。这些新的lncRNA和mRNA将与已知的lncRNA和mRNA一起进行后续的分析。

我们会对所有的RNA进行定量，进行差异分析，聚类分析，时间序列分析，富集分析等。我们预测lncRNA的靶基因，预测lncRNA家族分类以及潜在的miRNA前体。对于mRNA，我们会进行数据库注释，数据库包括NR，NT，GO，KOG，KEGG，UniProt，COG，Rfam，PfamTF，STRING等。我们的分析还包括可变剪接、基因融合等。完整的分析流程图见{{data.RenderAnchorLink("figure", "图", fn)}}。

{% endif %}

{% if data.ProjectInfo.ProjectType == 'DNBSEQ_RNAdenovo' or data.ProjectInfo.ProjectType == 'DNBSEQ_Strand-specific_RNAdenovo' %}

测序所得数据称为raw reads。首先，我们过滤掉rRNA，低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，过滤后的数据称为clean reads。然后使用Trinity进行转录本组装。对于组装得到的新转录本，我们将进行编码能力预测，以区分新的lncRNA和新的mRNA。这些新的lncRNA和mRNA将与已知的lncRNA和mRNA一起进行后续的分析。

我们会对所有的RNA进行定量，进行差异分析，聚类分析，时间序列分析，富集分析等。我们预测lncRNA的靶基因，预测lncRNA家族分类及潜在的miRNA前体。对于mRNA，我们会进行数据库注释，数据库包括NR，NT，GO，KOG，KEGG，UniProt，COG，Rfam，PfamTF，STRING等。完整的分析流程图见{{data.RenderAnchorLink("figure", "图", fn)}}。

{% endif %}

{% if data.ProjectInfo.ProjectType == 'DNBSEQ_RNAref' or data.ProjectInfo.ProjectType == 'DNBSEQ_Strand-specific_RNAref' %}

测序所得数据称为raw reads。首先，我们过滤掉rRNA，低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，过滤后的数据称为clean reads。然后将clean reads比对到参考基因组上，之后进行转录本组装。对于组装得到的新转录本，我们将进行编码能力预测，以区分新的lncRNA和新的mRNA。这些新的lncRNA和mRNA将与已知的lncRNA和mRNA一起进行后续的分析。

我们会对所有的RNA进行定量，进行差异分析，聚类分析，时间序列分析，富集分析等。我们预测lncRNA家族分类以及潜在的miRNA前体。对于mRNA，我们会进行数据库注释，数据库包括NR，NT，GO，KOG，KEGG，UniProt，COG，Rfam，Pfam，TF，STRING等。我们的分析还包括可变剪接、基因融合等。完整的分析流程图见{{data.RenderAnchorLink("figure", "图", fn)}}。

{% endif %}

{% if data.ProjectInfo.ProjectType == 'DNBSEQ_RNAseq' or data.ProjectInfo.ProjectType == 'DNBSEQ_Strand-specific_RNAseq' %}

测序所得数据称为raw reads。首先，我们过滤掉rRNA，低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，过滤后的数据称为clean reads。

我们会对所有的mRNA进行定量，进行差异分析，聚类分析，时间序列分析，富集分析等。对于mRNA，我们会进行数据库注释，数据库包括NR，NT，GO，KOG，KEGG，UniProt，COG，Rfam，Pfam，TF，STRING等。我们的分析还包括可变剪接、基因融合等。完整的分析流程图见{{data.RenderAnchorLink("figure", "图", fn)}}。

{% endif %}



{{data.RenderAnchor("figure", fn)}}

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/Analysis_flow_cn.png
subTitle: 图{{fn}} 信息分析流程图
title: 分析流程
```
{% set fn = fn + 1%}

{% if data.FileExists("Filter") %}

## 数据过滤

受样品质量和物种的影响，实验方法去核糖体的效率可能不太稳定，而核糖体的污染会影响后续的分析，因此我们首先使用短reads比对工具bowtie2将Reads比对到核糖体数据库，最多允许5个错配，去除比对上核糖体的reads，将保留下来的数据用于后续分析。

我们将含adapter、含N过多或含大量低质量碱基的reads统称dirty raw reads，信息分析前需要去除这些reads。过滤的步骤如下:

1）去除含adapter的reads

2）去除含N比例大于1%的reads

3）去除低质量的reads (我们定义质量值低于 15 的碱基占该reads总碱基数的比例大于 40% 的reads为低质量的reads)。


过滤后的数据称为clean reads,仍然以FASTQ格式存储（参见帮助页面FASTQ格式说明），该序列文件可直接用于发表，公共数据库提交等，后续分析都基于此文件。

软件信息：

SOAPnuke:

版本：v2.3

参数：-l 20 -q 0.4 -n 0.01

官网：https://github.com/BGI-flexlab/SOAPnuke


{% endif %}


{% if data.FileExists("Assemble") %}

## 组装

{{data.RenderAnchor("figure", fn)}}

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/pic_Assembl.png
subTitle: 图{{fn}} 组装流程图
title: pic_Assembl
```
{% set fn = fn + 1%}

我们使用比对软件HISAT2{{data.RenderReference(1)}}将clean reads比对到参考基因组上，HISAT2是一款用于RNA-seq reads剪切比对的快速、灵敏的比对软件，相比其他软件具有更高的准确性。Reads比对到基因组后，将会用StringTie{{data.RenderReference(2)}}进行组装。组装方法详见{{data.RenderAnchorLink("figure", "图", fn)}}{{data.RenderReference(19)}}。我们采用HISAT和StringTie的链特异性模式进行比对和组装，能更准确地区分reads来源于正链或者负链，更加准确地统计转录本的数量和发现新的基因。

{{data.RenderAnchor("figure", fn)}}

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/pic_StringTie.png
title: lncRNA_pipe
subTitle: 图{{fn}} StringTie的组装策略
desc: a. Reads 比对至参考基因组。b. 在一个比对区域构建出所有可能转录本的连接图。c, d. 串联连接图的线路将重叠的reads组装成多种转录本。
```
{% set fn = fn + 1%}


转录本重构之后，我们得到每个样品中所有的转录本序列，此时，我们用cuffcompare（Cufflinks{{data.RenderReference(20)}}的工具之一）将这些转录本与已知的mRNA及lncRNA进行比较，获得它们相互位置关系的信息。

对于单个转录本的组装结果，我们要求每个转录本满足以下要求：

1）FPKM >= 0.5

2）{{data.RenderHover("Coverage")}} > 1

3）Length > 200

通过对NONCODE{{data.RenderReference(22)}}数据库中的lncRNA分类统计，我们发现这五类i,j,u,x,o{{data.RenderReference(21)}}所包含的lncRNA也是最多的，因此我们保留了这部分转录本。

{{data.RenderAnchor("figure", fn)}}

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/pic_noncode.png
subTitle: 图{{fn}} NONCODE的lncRNA分类统计图
title: pic_noncode
```
{% set fn = fn + 1%}

低表达的基因在单次重复中由于测序深度不足而组装不充分，但对多次组装的结果进行合并后往往能获得相对完整的转录本。{{data.RenderReference(23)}}我们用Cuffmerge（Cufflinks{{data.RenderReference(20)}}的工具之一）组装结果进行合并，合并后的转录本作为最终的结果并用于后续的分析。

{{data.RenderAnchor("figure", fn)}}

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/pic_merget.png
subTitle: 图{{fn}} 转录本合并示意图
title: pic_merget
```
{% set fn = fn + 1%}

软件信息：

HISAT2:

版本：v2.2.1

参数：--sensitive --no-discordant --no-mixed -I 1 -X 1000 -p 8 --rna-strandness RF

官网：http://daehwankimlab.github.io/hisat2/

StringTie:

版本：v2.2.1

参数：-f 0.3 -j 3 -c 5 -g 100 -s 10000 -p 8

官网：https://github.com/gpertea/stringtie

Cufflinks:

版本：v2.2.1

参数：默认参数

官网：http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks

{% endif %}


{% if data.FileExists("Assemble_denovo") %}

我们使用Trinity进行组装，然后使用cdhit对组装得到的转录本进行去冗余。最后我们使用单拷贝直系同源数据库BUSCO对组装的转录本进行质量评估。根据组装结果，我们对转录本的SSR进行检测，同时为每个SSR设计引物。

软件信息：

Trinity:

版本：v2.13.2

参数：--seqType fq --max_memory 50G --group_pairs_distance 630  --no_version_check --full_cleanup  --min_contig_length 150  --CPU 8 --min_kmer_cov 3 --min_glue 3 --bfly_opts '-V 5 --edge-thr=0.1 --stderr '

官网：https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/


cdhit:

版本：4.6.1

参数：-n 10 -c 0.95

官网：https://sites.google.com/view/cd-hit

busco:

版本：v5.4.3

参数：-m tran -f --cpu 8 --offline

官网：https://busco.ezlab.org/

{% endif %}

{% if data.FileExists("Coding_Capacity") %}

## 编码能力预测

在获得新转录本以后，我们将对转录本的编码能力进行预测，以区分mRNA以及lncRNA。我们使用三款预测软件以及一个两个蛋白数据库进行预测。这三个软件分别是CPC2{{data.RenderReference(3)}}，LGC以及CNCI{{data.RenderReference(4)}}；数据库为Pfam{{data.RenderReference(5)}}与SwissProt。

Pfam与SwissProt为蛋白数据库，若转录本能够比对上蛋白数据库，则认为它是mRNA，否则为lncRNA。五种判断方法至少有三种的判断一致，且至少需要与一个蛋白数据库比对上，我们才确认该转录本为mRNA。

三款软件的打分阈值如下：

CPC2_threshold = 0，大于0的转录本为mRNA，小于0的为lncRNA

CNCI_threshold = 0，大于0的转录本为mRNA，小于0的为lncRNA

LGC_threshold = 0，大于0的转录本为mRNA，小于0的为lncRNA

软件信息：

CPC2 :

版本：无

参数：默认参数

官网：http://cpc2.gao-lab.org/index.php

CNCI:

版本：无

参数：默认参数

官网：https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI

LGC:

版本：LGC-1.0

参数：默认参数

官网：https://ngdc.cncb.ac.cn/lgc/calculator

{% endif %}

{% if data.FileExists("Quantification") %}

## 定量分析

我们使用Bowtie2{{data.RenderReference(6)}}将clean reads比对到参考序列，之后再使用RSEM{{data.RenderReference(7)}}计算基因和转录本的表达量，RSEM是通过建立起reads产生的模型，后运用最大似然方法确定如何分配reads到不同的转录本，我们采用链特异性模式，能区分reads来源于正负链，从而实现更精准地定量。

为了使样本间的表达量能够相互比较，需要对基因的表达量进行标准化处理。RSEM使用的标准化方法是FPKM。FPKM具体计算公式如下:

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/pic_fpkm.png
title: pic_fpkm
```

设FPKM(A)为基因A的表达量，则C为唯一比对到基因A的fragments数，N为唯一比对到参考基因的总fragments数，L为基因A编码区的碱基数。FPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因差异表达。

软件信息：

Bowtie2:

版本：2.4.5

参数：-q --sensitive --dpad 0 --gbar 99999999 --mp 1,1 --np 1 --score-min L,0,-0.1 -I 1 -X 1000 --no-mixed --no-discordant  -p 8 -k 20 -N 1

官网：http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml

RSEM:

版本：v1.3.1

参数：--forward-prob 0

官网：https://deweylab.github.io/RSEM/

{% endif %}

{% if data.FileExists("Coverage") %}

## 基因覆盖分析

我们使用Bowtie2{{data.RenderReference(6)}}将clean reads比对到基因参考序列，然后统计基因的覆盖情况。

分析步骤：

1）统计基因的每个位点的深度信息

2）将基因划分为100个bin，统计每个bin的平均覆盖深度

3）先对每个bin的覆盖深度进行归一化处理（除以100个bin中的最大值）

4）以5个bin为长度，步长为1，在基因区域内滑动；滑动的过程中，统计这5个bin的覆盖深度的均值；最后求这些均值的方差。

5）画图的数据是滑动窗口得到的均值，这些均值同样进行了归一化处理（除以最大值）

{% endif %}

{% if data.FileExists("Difference/Group_Diff")%}

## 组间差异分析

差异分析是通过比较样本的表达量，排除表达量变化不明显的基因，保留差异显著的基因。组间差异分析，即比较两组样本的基因表达量，一个组可有多个样本，一般一个是对照组，一个是处理组。我们使用差异分析软件{{diffMethod}}进行组间差异分析。

显著差异基因的过滤条件：

{% if diffMethod == 'DEseq2' %}
{{diffMethod}} : abs(log2FC) >= {{reportDataInfo.diff_cut_off_info.DEseq2.log2FC}} and Qvalue <= {{reportDataInfo.diff_cut_off_info.DEseq2.Qvalue}}
{% endif %}

{% if diffMethod == 'DEGseq' %}
{{diffMethod}} : abs(log2FC) >= {{reportDataInfo.diff_cut_off_info.DEGseq.log2FC}} and Qvalue <= {{reportDataInfo.diff_cut_off_info.DEGseq.Qvalue}}
{% endif %}

{% if diffMethod == 'NOIseq' %}
{{diffMethod}} : abs(log2FC) >= {{reportDataInfo.diff_cut_off_info.NOIseq.log2FC}} and Probability >= {{reportDataInfo.diff_cut_off_info.NOIseq.Probability}}
{% endif %}

{% endif %}

{% if data.FileExists("Difference/Sample_Diff")%}

## 样本间差异分析

差异分析是通过比较样本的表达量，排除表达量变化不明显的基因，保留差异显著的基因。样本间差异分析，即比较两个样本间的基因表达量，一般一个是对照样本，一个是处理样本。我们使用差异分析方法PossionDis{{data.RenderReference(9)}}进行样本间差异分析。

显著差异基因的过滤条件：

PossionDis：abs(log2FC) >= 1 and {{data.RenderHover("FDR")}}   <= 0.001

{% endif %}


{% if data.FileExists("Cluster_Pheatmap") %}

## 聚类分析

为了寻找表达趋势相似的基因，我们利用软件pheatmap对基因的表达量进行聚类。多个样本聚类时，我们取表达基因的并集。

软件信息：

pheatmap:

版本：1.0.12

参数：默认参数

官网：https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html

{% endif %}

{% if data.FileExists("Cluster_Mfuzz") %}

## 时间序列分析

聚类是分析基因表达数据的常用方法。聚类算法分为两种：严格聚类（hard clustering）和宽松聚类（soft clustering）。严格聚类会将一个基因只聚到一个簇中，这对那些分得很开的基因簇是有效的。但对于表达量数据来说，该方法是不适宜的，因为基因簇常常会有重叠。然而，宽松聚类可以解决这个问题。本项目使用的时间序列分析软件Mfuzz{{data.RenderReference(26)}}就是基于宽松聚类算法。Mfuzz是基于R的一个软件包，能够根据相似的表达谱将基因聚类，有助于找到功能相似的基因；同时表达趋势一致的基因可能参与同一个生物过程，有助于发现调控基因。

Mfuzz的membership是一个0~1的值，用来评估基因是否符合基因簇的变化趋势，其值越靠近1说明基因的趋势越符合该基因簇的变化趋势。

软件信息：

Mfuzz:

版本：2.54.0

参数：默认参数

官网：http://mfuzz.sysbiolab.eu

{% endif %}

{% if data.FileExists("Cluster_WGCNA") %}

## 共表达分析-WGCNA

WGCNA（Weighted Gene Co-expression Network Analysis）是一种常用的基因共表达网络分析方法，它可以从大规模的基因表达数据中找
到基因之间的关联关系，并将具有相似表达模式的基因聚合成模块。表型关联分析也是WGCNA分析的最终目的之一，它可以帮助我们找到与
表型特征相关的基因模块和核心基因。分析软件为WGCNA。

软件信息：

WGCNA：

版本：1.72-1

参数：默认参数

官网：https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA/

{% endif %}

{% if data.FileExists("Annotation") %}

## 基因注释

为了更好地了解基因功能，我们将对RNA进行注释。mRNA注释的数据库包括: NR，NT，GO，KOG，KEGG，uniprot，COG，Rfam，TF。而lncRNA注释的数据库包括：miRBase，Rfam。

我们使用blast将mRNA比对到NT；使用diamond将mRNA比对到NR，KOG，KEGG，uniprot，COG，TF（动物的转录因子数据库为AnimalTFDB3，植物的转录因子数据库为PlantTFdb5）；同时基于uniprot（包括sprot与trembl）比对信息获取GO的注释信息。我们使用infernal将lncRNA/mRNA比对到Rfam；使用diamond将lncRNA比对到miRBase（miRNA前提序列）。


软件信息：

blast:

版本：2.7.1

参数： -dust no -evalue 1e-15  -num_threads  5  -max_target_seqs 5 -outfmt "6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore stitle"

官网：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

infernal:

版本：1.1.4

参数：默认参数

官网：https://code.google.com/p/interproscan/wiki/Introduction

Diamond:

版本：v2.0.15.153

参数：默认参数

官网：https://github.com/bbuchfink/diamond

{% endif %}

{% if data.FileExists("Target")%}

## lncRNA靶基因分析

LncRNA的功能主要通过cis或trans方式作用于靶基因来实现。

Cis作用靶基因预测基本原理认为lncRNA的功能与其坐标邻近的蛋白编码基因相关，因此将lncRNA邻近的mRNA筛选出来作为其靶基因。而trans调控则不依赖于位置关系,我们是通过计算结合能的方法进行预测。

若lncRNA与靶基因存在overlap，我们将会对overlap的情况进行细致的分类，这将利于我们了解cis调控的细节。{{data.RenderReference(15)}}{{data.RenderReference(16)}}

靶基因分析方法：

计算lncRNA与mRNA的两个相关系数spearman与pearson，要求spearman_cor>=0.6且pearson_cor>=0.6。

cis与trans分析：lncRNA在mRNA上游10k或下游10k内则判定为cis。超出这范围的，将用RNAplex分析lncRNA与mRNA的结合能，若结合能<-60,则判定为tran。

{% endif %}

{% if data.FileExists("Rich") or data.FileExists("Rich_target") or data.FileExists("Rich_mfuzz") or data.FileExists("Rich_wgcna") %}

## 富集分析

Gene Ontology和{{data.RenderHover("KEGG")}} 是作为目前对基因分类最为完善的两个数据库。因此我们选择了它们来划分基因的功能模块，如一个{{data.RenderHover("GO")}}  term作为功能模块，或一个pathway作为一个功能模块。

无论是显著的差异基因，还是lncRNA的靶基因，它们都是我们关心的候选基因。为了确定这些候选基因在哪些功能模块上更为集中，我们会进行富集分析。

若候选基因在某个功能模块显著富集，说明该功能模块候选基因的比例明显高于背景。所谓背景就是一个参照，一般都是以整体作为背景，如整体的候选基因比例。

为了定量地评估某个功能模块的候选基因是否富集，我们使用了超几何模型计算每个功能模块的候选基因的富集程度。

每个功能模块都有一个pvalue，pvalue越小，说明候选基因在此功能模块上越富集。然后我们对pvalue进行{{data.RenderHover("FDR")}}  校正，我们设定{{data.RenderHover("FDR")}}  <=0.01的功能视为显著富集。

显著富集的筛选条件：{{data.RenderHover("FDR")}}  <=0.01

pvalue计算方法：

{{data.RenderAnchor("figure", fn)}}

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/pic_hyper.png
title: pic_hyper
```

超几何分布的介绍：https://en.wikipedia.org/wiki/Hypergeometric_distribution

{% endif %}

{% if data.FileExists("GeneFusion") %}

## 融合基因检测

基因融合是指两个基因的全部或一部分的序列相互融合为一个新的基因的过程。形成融合基因的机制较为复杂：包括染色体易位、中间缺失、染色体倒置以及反式剪切等多种机制，如{{data.RenderAnchorLink("figure", "图", fn)}}所示。目前基因融合主要集中在癌症的研究中，比如，白血病、前列腺癌、乳腺癌等。研究表明融合基因与癌症的发生发展有很大关联，参与融合的基因常常是一些原癌基因。融合的结果多样：可能会产生新的融合蛋白，它兼具融合的两部分基因的功能或者具有新功能；也有可能某原癌基因与其他基因的强启动子融合导致该原癌基因高表达，等等。很多研究结果均表明融合基因可以作为癌症特有的分子标签和潜在的药物靶点，在癌症的临床诊断和治疗中有重要的意义。

{{data.RenderAnchor("figure", fn )}}

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/Gene_Fusion_Types.png
subTitle: 图{{fn}} 融合基因类型
desc: 融合基因形成的原因有：A)染色体易位； B)中间缺失； C)染色体倒置。
```
{% set fn = fn + 1%}

某些特定类型的染色体畸变及引起的融合基因，常用于癌症诊断，以提高精确度。 染色体显带分析、荧光原位杂交(fluorescence In Situ hybridization，FISH)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是诊断实验室常用的方法，但由于癌症基因组本身的复杂性，这些方法仍有明显缺陷。目前，随着高通量测序技术的发展，为融合基因的检测带来了更为准确、有效的方法。

我们使用Ericscript进行基因融合分析。

软件信息：

版本：v0.5.5

参数：默认参数

官网：https://github.com/databio/ericscript

{% endif %}

{% if data.FileExists("Alternative_Splicing") %}

## 可变剪接检测

我们使用rMATS检测不同样品间的差异剪接基因和样品自身的剪接事件。rMATS是一款对RNA-Seq数据进行差异可变剪接分析的软件，其通过rMATS统计模型对不同样本进行可变剪接事件的表达定量，然后以likelihood-ratio test计算P value来表示两组样品在IncLevel（Inclusion Level ） 水平上的差异， lncLevel 并利用Benjamini Hochberg算法对p value进行校正得FDR值。rMATS可识别的可变剪接事件有5种，分别是skippedexon (SE)外显子跳跃，alternative 5′ splice site (A5SS)第一个外显子可变剪接，alternative 3′ splice site (A3SS)最后一个外显子可变剪接，mutually exclusive exons (MXE)外显子选择性跳跃和 retained intron (RI)内含子滞留。

区分差异剪接基因与差异表达基因非常重要。不管基因表达量是否发生差异，只要该基因亚型的相对丰度发生差异，说明该基因受剪接事件调控。另一方面，如果基因表达量发生差异，不管该基因亚型的相对丰度是否发生差异，说明该基因受转录事件调控。我们使用 rMATS [5] 检测不同样品之间的差异剪接基因( DSG )和样品自身的剪接事件。rMATS计算inclusion亚型和skipping亚型的相对丰度，如图下所示，同时计算相应的Pvalue和 FDR 值来衡量样品间剪接差异的显著性，本项目中使用FDR<=0.05为判断标准，小于该阈值的DSG将定义为显著差异的DSG。

{{data.RenderAnchor("figure", fn)}}

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/rMATS.png
title: rMATS
subTitle: 图{{fn}} 各种剪接类型的相对丰度计算
```
{% set fn = fn + 1%}

软件信息：

版本：v4.1.2

参数：默认参数

官网：https://rnaseq-mats.sourceforge.net/

{% endif %}

{% if data.FileExists("SnpIndel/SNP") or data.FileExists("SnpIndel/Indel") %}

## SNP和InDel分析

根据参考基因组比对结果，我们使用GATK{{data.RenderReference(13)}}检测每个样品的 {{data.RenderHover("SNP")}} 和 {{data.RenderHover("InDel")}} 信息。过滤掉低质量的位点信息之后，结果存储为VCF格式。GATK是由Broad Institute研发的一款用于二代测序数据分析的软件包。该工具包提供了多种分析方法，主要关注变异检测和基因分型。稳健的架构、强大的处理引擎、高性能计算等特点使其在各类项目中得以广泛应用。GATK的分析流程如{{data.RenderAnchorLink("figure", "图", fn)}}所示，更多GATK信息请参考<a href="software.broadinstitute.org/gatk" target="_blank">GATK官网</a>。

{{data.RenderAnchor("figure", fn)}}

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/SNP_INDEL_workflow.png
title: SNP_INDEL_workflow
subTitle: 图{{fn}} GATK分析SNP和INDEL的流程
desc: 主要分为两个步骤：1.数据预处理（比对至基因组-标记重复序列-分割序列-碱基重校准，注：图中显示的是用STAR软件将Reads比>对至基因组，而本项目使用的是HISAT2软件）；2.变异检测（以HaplotypeCaller来检测SNP和Indel-变异位点过滤）。
```

{% set fn = fn + 1%}

软件信息：

GATK:

版本：v4.2.6

参数(检测)：默认参数

参数(过滤)：-window 35 -cluster 3 --filter-name FS -filter "FS > 30.0" --filter-name QD -filter "QD < 2.0"

官网：https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us

{% endif %}

{% if data.FileExists("cicrRNA")%}

## lncRNA成环分析

{{data.RenderAnchor("figure", fn)}}

```image
url: {{data.ReportRoot}}/md/pic/CIRI_pipeline.png
subTitle: 图{{fn}} CIRI检测circRNA的流程图
title: CIRI_pipeline
```

本研究使用CIRI{{data.RenderReference(27)}}软件进行CircRNA预测，CIRI是基于BWA-MEM{{data.RenderReference(27)}}基因组比对算法研发的软件，通过两次扫描比对生成的SAM（Sequence Alignment/Map）文件来检测circRNA。同一条read的前后两部分需要交叉比对至基因组才能证明是circRNA两端连接的序列（junction reads）。所以，在第一遍扫描过程中，CIRI会筛选具有成对交叉剪切（paired chiastic clipping，PCC）信号的junction reads，然后再通过双端reads比对（paired-end mapping，PEM）范围的限制和GT-AG剪切信号对junction reads进一步过滤。在第二遍SAM文件的扫描中，CIRI会探测新的junction reads，同时排除因错误比对至同源基因或重复序列造成的假阳性circRNA，从而提高软件的灵敏度及精确度{{data.RenderReference(27)}}。具体流程可参考{{data.RenderAnchorLink("figure", "图", fn)}}。

{% set fn = fn + 1%}

软件信息：

CIRI:

版本：v2.0.5

参数：默认

官网：https://sourceforge.net/projects/ciri/

{% endif %}

## 参考文献
{{ data.RenderReferenceFoot() }}

{% endblock %}